Izvještaj: Posebni nadzor viroida vretenavosti krtola krompira (Potato spindle tuber viroid, PSTVd)

Posebni nadzor Potato spindle tuber viroid realizuje se kao jedna od komponenti Programa Fitosanitarnih mjera za 2018. godinu. Aktivnosti na realizaciji programa obuhvatile su:

- uzorkovanja ukrasnih i gajenih biljaka na različitim lokalitetima na crnogorskom primorju i

- molekularne analize sakupljenih uzoraka u cilju utvrđivanja prisustva/odsustva viroida vretenavosti krtola krompira (Potato spindle tuber viroid, PSTVd).

Uzorkovanje:

Tokom avgusta mjeseca 2018. godine Fitosanitarna inspekcija je Virusološkoj laboratoriji  dostavila ukupno 20 uzoraka koji su pripadali sljedećim biljnim vrstama: Petunia sp. (10), Solanum lycopersicum L. (6), Brugmansia spp. (3) i Dahlia sp. (1). Biljni materijal je sakupljen na različitim lokalitetima u opštinama Kotor, Tivat i Budva (prilog 1).

Molekularne analize.

Laboratorijske analize u cilju detekcije viroida vretenavosti krtola krompira (PSTVd) obavljene su primjenom metode reverzne transkripcije i lančane reakcije polimeraze (Reverse Transcription, Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) i korišćenjem univerzalnih prajmera preporučenih od strane EPPO organizacije (EPPO Diagnostic protocols for regulated pests, PM 7/33). Kao početni biljni materijal korišćeno je lišće ukrasnih i gajenih biljaka.

RT-PCR metodi, koja je izvođena korišćenjem One-step RT-PCR kita (Qiagen, Njemačka), predhodila je ekstrakcija totalnih ribonukleinskih kiselina korišćenjem Rneasy Plant Mini kit-a (Qiagen, Njemačka). Pozitivna kontrola za PSTVd (oznaka S⁺) obezbjeđena je iz kolekcije izolata Virusološke laboratorije Kmetijskog instituta Slovenije, dok je kao negativna kontrola korišćen biljni materijal vrste Solanum jasminoides (uzorak 00/22), u kome 2014. godine nije utvrđeno prisustvo PSTVd. Produkti RT-PCR vizuelizovani su elektroforetski, u 1,5% TAE gelu. Kao DNA marker korišćen je 100 bp DNA ladder (Invitrogen, USA). Protokoli za ekstrakciju totalnih RNA kiselina i One-step RT-PCR metode dati su u prilogu 2 i 3.

U cilju amplifikacije genoma PSTVd, korišćeni su prajmeri PSTVd-forward i PSTVd-reverse, koji amplifikuju fragment veličine 359 bp i specifični su za detekciju različitih izolata PSTVd. Sekvence prajmera korišćenih u RT-PCR reakciji date su u tabeli 1.

Tabela 1. Sekvence prajmera korišćenih u RT-PCR reakciji

Rezultati molekularnih analiza su ukazali na odsustvo PSTVd u svim ispitivanim uzorcima koji su dostavljeni tokom 2018. godine.

U Prilogu je tabela sa rezultatima molekuarnih analiza uzoraka ukrasnog bilja i paradajza sakupljenih na različitim lokalitetima u Crnoj Gori tokom 2018. godine.