Posebni nadzor Potato spindle tuber viroid realizuje se kao jedna od komponenti Programa Fitosanitarnih mjera za 2018. godinu. Aktivnosti na realizaciji programa obuhvatile su:
- uzorkovanja ukrasnih i gajenih biljaka na različitim lokalitetima na crnogorskom primorju i
- molekularne analize sakupljenih uzoraka u cilju utvrđivanja prisustva/odsustva viroida vretenavosti krtola krompira (Potato spindle tuber viroid, PSTVd).
Uzorkovanje:
Tokom avgusta mjeseca 2018. godine Fitosanitarna inspekcija je Virusološkoj laboratoriji dostavila ukupno 20 uzoraka koji su pripadali sljedećim biljnim vrstama: Petunia sp. (10), Solanum lycopersicum L. (6), Brugmansia spp. (3) i Dahlia sp. (1). Biljni materijal je sakupljen na različitim lokalitetima u opštinama Kotor, Tivat i Budva (prilog 1).
Molekularne analize.
Laboratorijske analize u cilju detekcije viroida vretenavosti krtola krompira (PSTVd) obavljene su primjenom metode reverzne transkripcije i lančane reakcije polimeraze (Reverse Transcription, Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) i korišćenjem univerzalnih prajmera preporučenih od strane EPPO organizacije (EPPO Diagnostic protocols for regulated pests, PM 7/33). Kao početni biljni materijal korišćeno je lišće ukrasnih i gajenih biljaka.
RT-PCR metodi, koja je izvođena korišćenjem One-step RT-PCR kita (Qiagen, Njemačka), predhodila je ekstrakcija totalnih ribonukleinskih kiselina korišćenjem Rneasy Plant Mini kit-a (Qiagen, Njemačka). Pozitivna kontrola za PSTVd (oznaka S+) obezbjeđena je iz kolekcije izolata Virusološke laboratorije Kmetijskog instituta Slovenije, dok je kao negativna kontrola korišćen biljni materijal vrste Solanum jasminoides (uzorak 00/22), u kome 2014. godine nije utvrđeno prisustvo PSTVd. Produkti RT-PCR vizuelizovani su elektroforetski, u 1,5% TAE gelu. Kao DNA marker korišćen je 100 bp DNA ladder (Invitrogen, USA). Protokoli za ekstrakciju totalnih RNA kiselina i One-step RT-PCR metode dati su u prilogu 2 i 3.
U cilju amplifikacije genoma PSTVd, korišćeni su prajmeri PSTVd-forward i PSTVd-reverse, koji amplifikuju fragment veličine 359 bp i specifični su za detekciju različitih izolata PSTVd. Sekvence prajmera korišćenih u RT-PCR reakciji date su u tabeli 1.
Tabela 1. Sekvence
prajmera korišćenih u RT-PCR reakciji
|
Prajmeri |
Sekvenca prajmera |
Veličina amplikona |
|
PSTVd-forward |
5′-CCC TGA AGC GCT CCT CCG AG-3 |
359 bp |
|
PSTVd-reverse |
5′-ATC CCC GGG GAA ACC TGG AGC
GAA C-3′ |
Rezultati molekularnih analiza su ukazali na odsustvo PSTVd u svim ispitivanim uzorcima koji su dostavljeni tokom 2018. godine.
U Prilogu je tabela sa rezultatima molekuarnih analiza uzoraka ukrasnog bilja i paradajza sakupljenih na različitim lokalitetima u Crnoj Gori tokom 2018. godine.