Извјештај: Посебни надзор вироида вретенавости кртола кромпира (Потато спиндле тубер вироид, ПСТВд)

Посебни надзор Потато спиндле тубер вироид реализује се као једна од компоненти Програма Фитосанитарних мјера за 2018. годину. Активности на реализацији програма обухватиле су:

- узорковања украсних и гајених биљака на различитим локалитетима на црногорском приморју и

- молекуларне анализе сакупљених узорака у циљу утврђивања присуства/одсуства вироида вретенавости кртола кромпира (Потато спиндле тубер вироид, ПСТВд).

Узорковање:

Током августа мјесеца 2018. године Фитосанитарна инспекција је Вирусолошкој лабораторији  доставила укупно 20 узорака који су припадали сљедећим биљним врстама: Петуниа сп. (10), Соланум лyцоперсицум Л. (6), Бругмансиа спп. (3) и Дахлиа сп. (1). Биљни материјал је сакупљен на различитим локалитетима у општинама Котор, Тиват и Будва (прилог 1).

Молекуларне анализе.

Лабораторијске анализе у циљу детекције вироида вретенавости кртола кромпира (ПСТВд) обављене су примјеном методе реверзне транскрипције и ланчане реакције полимеразе (Реверсе Трансцриптион, Полyмерасе Цхаин Реацтион, РТ-ПЦР) и коришћењем универзалних прајмера препоручених од стране ЕППО организације (ЕППО Диагностиц протоцолс фор регулатед пестс, ПМ 7/33). Као почетни биљни материјал коришћено је лишће украсних и гајених биљака.

РТ-ПЦР методи, која је извођена коришћењем Оне-степ РТ-ПЦР кита (Qиаген, Њемачка), предходила је екстракција тоталних рибонуклеинских киселина коришћењем Рнеасy Плант Мини кит-а (Qиаген, Њемачка). Позитивна контрола за ПСТВд (ознака С⁺) обезбјеђена је из колекције изолата Вирусолошке лабораторије Кметијског института Словеније, док је као негативна контрола коришћен биљни материјал врсте Соланум јасминоидес (узорак 00/22), у коме 2014. године није утврђено присуство ПСТВд. Продукти РТ-ПЦР визуелизовани су електрофоретски, у 1,5% ТАЕ гелу. Као ДНА маркер коришћен је 100 бп ДНА ладдер (Инвитроген, УСА). Протоколи за екстракцију тоталних РНА киселина и Оне-степ РТ-ПЦР методе дати су у прилогу 2 и 3.

У циљу амплификације генома ПСТВд, коришћени су прајмери ПСТВд-форwард и ПСТВд-реверсе, који амплификују фрагмент величине 359 бп и специфични су за детекцију различитих изолата ПСТВд. Секвенце прајмера коришћених у РТ-ПЦР реакцији дате су у табели 1.

Табела 1. Секвенце прајмера коришћених у РТ-ПЦР реакцији

Резултати молекуларних анализа су указали на одсуство ПСТВд у свим испитиваним узорцима који су достављени током 2018. године.

У Прилогу је табела са резултатима молекуарних анализа узорака украсног биља и парадајза сакупљених на различитим локалитетима у Црној Гори током 2018. године.